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SMCC交联剂及其水溶性类似物Sulfo-SMCC交联剂是含有能够与含胺基和巯基分子共价交联的马来酰亚胺基团和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的异双功能交联剂。NHS-酯能够与pH7～9缓冲液中的伯氨基(-NH2)有效反应形成稳定的酰胺键，而马来酰亚胺与pH6.5～7.5的巯基反应形成稳定的硫醚键。在水溶液中，NHS酯的水解是该反应的竞争反应，速率随pH升高而加快。马来酰亚胺基团比NHS-酯基团更稳定，但在pH值> 7.5时，也会缓慢水解并失去对巯基的反应特异性。因此这些交联剂的共轭实验通常在pH7.2～7.5下进行，其中NHS-酯(胺基靶向)反应在马来酰亚胺(巯基靶向)反应之前或同时进行。

试剂间隔臂中存在环己烷环，与不含该环的类似试剂相比，该试剂降低了马来酰亚胺基团的水解速率。使得用SMCC或Sulfo-SMCC进行马来酰亚胺活化的蛋白质能够被冻干和储存，然后继续与含巯基的分子共轭。这种方法多用来生产很多马来酰亚胺活化的蛋白质产物。

SMCC和Sulfo-SMCC通常用于在两步反应法中制备抗体-酶和半抗原-载体蛋白的共轭物。首先，将含胺蛋白质与数倍摩尔过量的交联剂反应，然后通过脱盐或透析除去过量(未反应)的试剂，然后加入含巯基的分子与已经连接到第一种蛋白质上的马来酰亚胺基团反应，形成目标共轭物。

Sulfo-SMCC可溶于水和许多其他水相缓冲液，最大约10mM，但溶解度随着会盐浓度的增加而降低。SMCC不能直接溶于水，必须先溶解在有机溶剂如二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入水相反应缓冲液中稀释，有机溶剂的最终浓度若小于10%，则大多数蛋白质反应物能保持溶解状态。

名称	SMCC	Sulfo-SMCC
全称	succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate	sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate
中文名称	4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯	4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐
货号	GS4331	GS4332
CAS号	64987-85-5	92921-24-9
分子量	334.32	436.37
水溶性	不溶于水	溶于水
结构式
纯度	>98% on TLC
间隔臂	8.3 Å
增加质量	219.09

• SMCC和Sulfo-SMCC对湿度敏感。在规定温度下干燥保存。为了避免产品中的水分冷凝，开瓶前必须平衡到室温。实验前溶解所需量，并在水解发生前立即使用，不要制备储存液，丢弃任何未使用的重构试剂。
  
• 无称量微管处理：使用前立即用移液管刺穿微管箔，加入200μL 50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0～7.5)或超纯水，上下移动混匀。使用后，从微管中切出用过的微管并将其丢弃。将未使用的微管存放在箔袋中。
  
  • 不要使用磷酸盐缓冲液(PBS)初步溶解Sulfo-SMCC，该试剂在超过50mM总盐的缓冲液中不能很好地溶解。但是一旦溶解，可以进一步用PBS或其它非胺缓冲液稀释。
• 避免在共轭过程中使用含有伯胺和巯基的缓冲液，因为它们会与预期的反应竞争。如有必要，将样品透析或脱盐，转换为合适的缓冲液，如磷酸盐缓冲液(PBS)。
  
• 与马来酰亚胺部分反应的分子必须具有游离的(还原的)巯基。可以用固定的TCEP二硫化物还原肽二硫键。使用5mM TCEP(1∶100稀释的TCEP溶液)在室温下还原高分子量蛋白质中的二硫键，30min，然后用脱盐柱去除TCEP。请注意，蛋白质(例如抗体)可能因二硫键的完全还原而失活。选择性还原IgG铰链区中二硫键的可以用2-巯基乙胺·HCl完成。可以使用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA产品)或2-亚氨基硫烷·HCl(Traut's Reagent)将巯基加成到蛋白分子中，修饰伯胺。

• 材料准备：
  
  • 共轭缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，100mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH7.2)或pH6.5～7.5的其他无胺和无巯基的缓冲液，加入1～5mM EDTA有助于螯合二价金属，从而防止含巯基的蛋白质形成二硫化物。
    
  • 脱盐柱处理，去除过量的交联剂和反应副产物(如自旋柱)。
    
  • 需要结合的含胺的蛋白质(Protein-NH2)和含巯基的蛋白质(Protein-SH)。
• 操作步骤：
  为了获得最佳效果，确保已准备好Protein-SH(参见相关产品信息)，并准备在第5步中与Protein-NH2结合。
  
  • 将蛋白质-NH2溶解在0.1mM的共轭缓冲液中。
    
  • 向蛋白质溶液中加入适量的交联剂。蛋白质-NH2的浓度决定了交联剂的用量。建议交联剂摩尔量如下。
    
    • <1mg/mL的蛋白质样品，使用40～80倍摩尔过量的交联剂。
      
    • 1～4mg/mL的蛋白质样品，使用20倍摩尔过量的交联剂。
      
    • 5～10mg/mL的蛋白质样品，使用5～10倍摩尔过量的交联剂。
    表1．用于1mL样品的交联剂的量。使用前立即将交联剂溶解在适当的溶剂中(括号中的浓度，加入蛋白质样品前的浓度)，然后将列出的体积添加到1mL蛋白质样品中。
    

    Protein-NH2的浓度(50kDa)	10mg/mL	1mg/mL	0.5mg/mL
    交联剂摩尔比	5×	20×	50×
    Sulfo-SMCC(50mM磷酸盐或水)	100μL(4.8mg/mL)	40μL(4.8mg/mL)	50μL(4.8mg/mL)
    SMCC(DMSO/DMF)	100μL(3.7mg/mL)	100μL(1.5mg/mL)	100μL(1.8mg/mL)

    • 如果Sulfo-SMCC溶液不能完全溶解，可以放在50℃水浴中孵育数分钟。
  • 室温或4℃下孵育30分钟。
    
  • 用共轭缓冲液平衡的脱盐柱去除过量的交联剂。
    
  • 将蛋白质-SH和脱盐处理后的组合蛋白质-NH2混合，其摩尔比对应于最终交联物所需的摩尔比，并与两种蛋白质上存在的巯基和活化胺的相对数量一致。
    
  • 室温孵育30分钟或4℃孵育2小时。
    
    • 一般来说，尽管反应通常在规定的时间内完成，反应进行数小时或过夜没有任何危害。在共轭反应完成前停止，可以加入浓度比蛋白质-SH的巯基高几倍的含有还原半胱氨酸的缓冲液。
      
    • 通过电泳和随后的蛋白质染色可以估计结合效率。